OS ORGANISMOS PROCARIONTES: DOMÍNIOS BACTERIA E ARCHAEA

 

OS SERES PROCARIONTES: DOMÍNIOS BACTERIA E ARCHAEA

 

Os organismos procariontes, ou seja, aqueles cujas células não apresentam envelope nuclear, até recentemente eram classificados como pertencentes ao “Reino Monera”, porém, atualmente esses tipos de organismos são categorizados em dois domínios, os Domínios Bacteria e o Archaea. Ambos os tipos de organismos têm aspecto similar quando vistos ao microscópio, porém, apresentam algumas diferenças em nível molecular.

 

Filogenia dos três Domínios de organismos baseada em análises de sequências de rRNA, de acordo com Woese et al. (1990). Perceba que o domínio Archaea é mais próximo do Eukaryota. Imagem: Wikipedia.

 

As arqueas são seres geralmente associados aos ambientes extremos (salinidade, temperatura, pH…) e diferem das bactérias por possuírem rRNA 16 S distinto (16 S se refere ao coeficiente de sedimentação da molécula), parede celular de composição distinta, constituídas de proteínas e glicoproteínas, sem peptidioglicanos (os peptidioglicanos são complexos de aminoácidos com glicídeos, exclusivos do domínio Bacteria), possuem histonas, com as quais podem compactar o DNA cromossomal (as bactérias não possuem) e apresentam os processos de transcrição gênica e tradução (síntese proteica) mais semelhantes aos dos seres eucariontes, tendo, inclusive, genes con íntrons. Assim, são efetivamente mais proximamente relacionadas aos eucariontes e podemos dizer que os domínios Archaea e Eukarya constituem um grupo monofilético. 

A maioria do que será visto aqui é referente às bactérias, pois são os principais representantes dos procariontes, podendo ser encontradas em uma variedade enorme de ambientes, tendo vários papeis ecológicos e podendo ser utilizadas por nós em vários processos. Vale também mencionar que nem todas as arqueas habitam ambientes extremos e também há bactérias em ambientes extremos, um bom exemplo é a bactéria Thermus aquaticus, cuja polimerase é utilizada no procedimento de amplificação de DNA chamado de PCR (polymerase chain reaction).

 

Características gerais das bactérias e arqueas:

 

- Unicelulares, que podem viver isolados ou em colônias (organismos ligados fisicamente). (*Porém, pode haver procariontes multicelulares, como as magnetotáticas. Isso ainda é discutido, mas quase tudo em biologia tem exceções...).

- Procariontes, ou seja, não possuem membrana nuclear (carioteca). Note que é errado dizer que esses organismos não têm organelas, pois pelo menos os ribossomos eles possuem, mas acontece que os procariontes praticamente não possuem organelas membranosas como os eucariontes. Há possíveis exceções em alguns procariontes, por exemplo: 

A. Compartimentos membranosos semelhantes aos acidocalcissomos de eucariontes, cujas funções parecem estar relacionadas ao armazenamento de íons Ca⁺², metabolismo energético e regulação do pH celular. 

B. Os tilacoides, que além dos cloroplastos podem ser encontrados em bactérias fotossintéticas, onde ocorre a etapa fotoquímica. 

C. Os magnetossomos, que contêm cristais de magnetita ou greigita e permitem a algumas bactérias perceber e se alinhar ao campo magnético da Terra. 

- Autotróficos ou heterótrofos, aeróbios ou anaeróbios. Há uma enorme diversidade de tipos de metabolismo entre os procariontes, de maneira que eles participam de vários nichos e têm enorme importância ambiental, tanto atuando como produtores quanto como consumidores e decompositores.

 

Exemplo de metabolismo e tipo de nutrição de procariontes com a produção de metano em sedimentos pela ação das arqueas metanogênicas. As bactérias metanotróficas oxidam o metano na interface ar-água, produzindo CO₂. Imagem: Bio, Volume Único. Lopes & Rosso. 2013. As arqueas metanogênicas liberam metano como subproduto do metabolismo energético e vivem em ambientes anaeróbicos, como os pântanos e os intestinos de herbívoros e cupins. O metano é um gás estufa e pode ser utilizado como combustível.

 

- As células bacterianas medem aproximadamente 0,5 e 5,0 µm (algumas exceções podem ser bem maiores). No tocante à estrutura, têm membranas plasmáticas constituídas de bicamadas fosfolipídicas, assim como as dos eucariontes. No citoplasma, há ribossomos, talvez algumas organelas, o cromossomo bacteriano, que tem formato circular e, além dessa molécula de DNA, há outras, também circulares, porém menores e acessórias, os plasmídeos, que podem conter genes que conferem resistência contra antibióticos e podem ser replicados e transferidos entre as células. Os plasmídeos são amplamente utilizados em biotecnologia como vetores de expressão heteróloga (neles podem ser inseridos genes de outros organismos, para que as bactérias sintetizem os produtos desses genes).

 

A imagem mostra a estrutura de uma bactéria gram positiva hipotética, com várias das suas estruturas. Imagem: Wikipedia.

 

- A parede celular é um envoltório rígido que recobre a célula e contribui para a manutenção do seu formato. Nas bactérias é constituída de peptidioglicanos: polímeros de carboidratos interligados por aminoácidos. Algumas bactérias e arqueas não possuem parede e as paredes das arqueas são constituídas de proteínas e polissacarídios, apesar de que algumas possuem peptidioglicanos, mas distintos dos das bactérias. A diversidade é muito grande e lembrando, quase sempre há exceções em biologia.

 

- Podem apresentar um ou mais flagelos, estruturas utilizadas para a locomoção, geralmente constituídas de um longo filamento que se estende a partir da superfície da célula, associado a um motor localizado na membrana e parede celular. Este motor pode girar até 15 mil vezes por minuto. Os flagelos bacterianos apresentam composição e funcionamento distintos dos flagelos das células eucarióticas.

 

- Algumas bactérias secretam para o seu exterior uma cobertura gelatinosa, composta de proteínas e/ou polissacarídios, chamada cápsula bacteriana. Esta estrutura dificulta a fagocitose das bactérias pelas células fagocitárias do sistema imune (macrófagos e monócitos), logo, podem contribuir para a sua patogenicidade, no caso das bactérias patogênicas.

- Às vezes as bactérias podem se apresentar na forma de endósporos, uma forma de resistência. Quando as condições ambientais são adversas, dá-se início a um processo em que a célula desidrata, duplica seu cromossomo e forma uma parede espessa ao redor de um dos cromossomos. Esta estrutura não apresenta metabolismo, mas pode ser reativada quando as condições ambientais voltam a ser favoráveis. Como há a duplicação do cromossomo bacteriano, alguns autores/pesquisadores consideram a formação dos endósporos como um tipo de reprodução agamética/assexuada.

 

Exemplo de formação de um endósporo. Imagem: Wikipedia.

 

No que diz respeito à parede celular, as bactérias podem ser classificadas em dois grupos básicos (há exceções...) de acordo com o método de coloração de Gram. Este método consiste em submeter as bactérias a um tratamento com dois corantes, um violeta e um rosa, e após o tratamento podem se identificar dois tipos distintos de bactérias:

 

- Gram positivas: apresentarão coloração violeta. Possuem uma parede celular espessa externamente à membrana plasmática.

- Gram negativas: apresentarão coloração rosa, pois não retêm o corante violeta. Externamente à membrana plasmática também possuem uma parede celular, porém mais fina e além dela há outra membrana fosfolipídica. Entre a membrana plasmática e a parede celular há um espaço chamado de espaço periplásmico.

O método de coloração de Gram. Imagem: https://laboratoryinfo.com/

 

Esse método de identificação pode constituir um passo preliminar na identificação e tratamento de certas infecções bacterianas.

No que diz respeito à forma, as bactérias podem ser:

 

Unicelulares:

- Cocos: Formato esférico.

- Bacilo: Formato de bastonete.

- Vibrião: formato de vírgula.

- Espirilo: Formato espiralado.

 

Colônias (indivíduos ligados fisicamente):

- Diplococos, estreptococos, sarcinas (cubo) e estafilococos (cacho).

- Diplobacilos e estreptobacilos.

A imagem mostra vários dos formatos mais comuns das bactérias. Veja essa também. Normalmente não é preciso decorar isso.

Metabolismo dos procariontes:

 

Quanto à nutrição e ao metabolismo das células procariontes, como mencionado, há uma grande variedade. Elas podem ser autótrofas fotossintéticas, tanto oxígenas, como as cianobactérias, como anoxígenas, como as sulfurosas, que liberam enxofre (S) ao invés de O₂. As arqueas halófitas extremas realizam fotossíntese com o pigmento bacteriorrodopsina, a fotossíntese mais simples.

 

Há vários exemplos de arqueas quimiossintéticas que habitam os ambientes extremos ou os anóxicos e também as bactérias que atuam no ciclo do nitrogênio (Nitrosomonas e Nitrobacter), para citar alguns exemplos.

 

Dentre as heterótrofas pode haver as aeróbicas, anaeróbicas facultativas (ex: Escherichia coli) e as anaeróbicas obrigatórias (ex: Clostridium sp.), havendo então, variação nos processos responsáveis pela geração de energia, como a fermentação, respiração aeróbica e respiração anaeróbica. Ainda, bactérias saprofágicas são as que obtêm seu alimento a partir da matéria orgânica morta, como os cadáveres, sendo assim, atuam como decompositoras, reciclando a matéria orgânica complexa, ao transformá-la em matéria orgânica simples, que pode ser utilizada por outros seres vivos, mais especificamente, os produtores nos ecossistemas. As parasitas obtêm seu alimento instalando-se nos organismos ainda vivos, podendo causar doenças.

 

Imagem mostrando as bactérias que atuam no ciclo do nitrogênio e o papel de outras bactérias que podem, junto com os fungos, por exemplo, atuar como decompositoras. No caso da imagem, essas decompositoras produzem amônia a partir dos restos dos organismos. Imagem: https://wps.prenhall.com/wps/media/objects/2478/2537811/Media-Portfolio/chapter_07/07.html

Reprodução das bactérias:

As bactérias se reproduzem de forma assexuada por divisão binária ou cissiparidade, processo em que uma célula duplica seu DNA, e se divide em duas (idênticas). Note que esse processo não é a mitose, pois inclusive esse termo se refere à divisão do núcleo e é utilizado para as células eucariontes.

 

Processo de divisão binária em uma célula procarionte qualquer. Imagem: Wikipedia.

 

Apesar das bactérias não apresentarem reprodução sexuada/gamética, podem adquirir sequências de DNA contendo genes de outras bactérias, processo denominado transferência gênica horizontal. Pode se dar de três formas básicas:

- Transformação: absorção de moléculas de DNA dispersas no ambiente, provenientes de bactérias mortas. As moléculas de DNA podem trazer genes novos para a bactéria que os absorve.

- Transdução: transferência de sequências de DNA de uma bactéria para outra a partir de um vírus bacteriófago. Neste caso, a montagem do bacteriófago ocorreu de forma errônea e ao invés do seu capsídeo conter o material genético viral, na verdade contém um fragmento do DNA da bactéria que ele havia infectado. Ao infectar outra bactéria, injeta este DNA, que pode se incorporar ao cromossomo da bactéria que está sendo invadida agora.

Conjugação: transferência direta de DNA entre duas bactérias através de tubos proteicos chamados pili, fímbrias ou pelos sexuais.

 

Imagem ilustrando de maneira bem simplificada os três processos de recombinação gênica que podem ocorrer em bactérias.

 

Importância dos procariontes.

 

Aqui serão mencionados aspectos mais associados com as bactérias. 

Esses organismos têm importância ambiental, pois os procariontes autótrofos podem agir como produtores e outros, heterótrofos, como decompositores da matéria orgânica. São muito utilizados em processos da biotecnologia e também têm importância fundamental na nossa saúde, pois, além de causarem doenças, um número enorme sobrevive em nossos corpos fazendo parte daquilo que chamamos de microbiota. Os organismos componentes dessa microbiota podem prevenir infecções pelos micro-organismos patogênicos e também produzir substâncias de interesse para nós, como exemplos as vitaminas K e algumas vitaminas B. Veremos um pouco mais sobre a microbiota adiante.

 

As bactérias e o ciclo do nitrogênio: para que possa ser absorvido pelos seres vivos, o elemento N, na forma de gás nitrogênio, N₂, é inicialmente absorvido pelas bactérias fixadoras de nitrogênio. Elas converterão o N₂ em amônia, NH₃, que por sua vez, pode ser absorvido por algumas plantas. Outras bactérias, as chamadas bactérias nitrificantes, transformam o NH₃ (ou NH₄⁺) em Nitrato, NO₃^–. Sendo que os nitratos são as substâncias contendo nitrogênio mais facilmente absorvidas pelas plantas. Isto se dá em duas etapas:

 

Bactérias do gênero Nitrosomonas convertem a amônia ou o amônio em nitrito: 2NH₃ +3O₂ => 2NO₂^– + 2H₂O + 2H⁺ + Energia!

Bactérias do gênero Nitrobacter convertem o nitrito em nitrato: 2NO₂^– + O₂ => 2NO₃^– + Energia!

 

As bactérias fixadoras do gênero Rhizobium são capazes de infectar as raízes das plantas leguminosas, e viver de forma simbiótica com elas ao formar nódulos (que são tumores). A bactéria absorve o N₂, e compartilha com a planta as substâncias nitrogenadas que produz, ao passo que a planta fornece outras substâncias orgânicas às bactérias. Como estas plantas se tornam muito eficientes no processo de fixação de nitrogênio, ao morrerem, acabam fertilizando o solo, pois liberam o nitrogênio na forma de amônia.

 

Além dos processos de fixação e nitrificação, outras bactérias são capazes de converter o NO₃^– em N₂, devolvendo o elemento N para a atmosfera. Estas são as bactérias desnitrificantes e o processo pelo qual fazem isso é chamado desnitrificação.

 

Bactérias e biotecnologia: as bactérias têm sido intensamente utilizadas nos processos de expressão de genes heterólogos, ou seja, inserir no genoma bacteriano genes de outros tipos de seres vivos, como o gene da insulina humana, para que elas possam produzi-los com fins comerciais. Basicamente, este processo é feito com o uso das chamadas enzimas de restrição, produzidas pelas bactérias, cujo intuito é cortar, em pontos específicos, o DNA de bacteriófagos que venham a infectá-las. Pode se utilizar estas mesmas enzimas para se cortar qualquer molécula de DNA. Sendo assim, utiliza-se estas enzimas para se inserir genes de interesse (como o da insulina humana) em plasmídios bacterianos. Os plasmídios contendo os genes de interesse são então introduzidos nas bactérias e elas passam a produzir a proteína heteróloga.

Esquema mostrando uma forma de se expressar genes heterólogos em bactérias utilizando plasmídeos como os vetores de expressão. Os plasmídeos utilizados devem ter um gene que confira resistência contra antibióticos (como a ampicilina ou kanamicina). (1). Isola-se a sequência de DNA do gene de interesse. (2). Insere-se o DNA de interesse no plasmídeo vetor. 2a. cortam-se o DNA com o gene de interesse e o DNA vetor com a mesma enzima de restrição, 2b. ao se misturar as moléculas de DNA em solução elas se anelam graças ao pareamento das bases nitrogenadas, 2c. a enzima DNA ligase une os fragmentos às suas relativas cadeias de nucleotídeos. Daí se obtém um plasmídeo recombinante. (3). Introduz-se o plasmídeo recombinante em Escherichia coli. (4) As células são clonadas. 4a. as células são cultivadas em uma placa com ágar contendo antibiótico (no caso da imagem, ampicilina), 4b. cada colônia contém o plasmídeo recombinante e a habilidade de crescer em ágar com ampicilina. (5) Escolhem-se colônias a serem cultivadas em um meio de cultura maior, para multiplicar os plasmídeos. (6) Isolam-se os DNAs das culturas amplificadas. (7) Transferem-se os plasmídeos recombinantes para as células desejadas (como outras bactérias, leveduras, células animais e etc.) e testam-se as propriedades do gene de interesse.

Imagem: https://www.researchgate.net/figure/Steps-for-recombinant-DNA-technology-Bacterial-plasmids-with-a-resistance-gene-present_fig1_273188183

As bactérias também podem ser utilizadas para se produzir plantas transgênicas. Isso é feito com o uso da bactéria Agrobacterium tumefaciens que apresenta o chamado plasmídio Ti (indutor de tumor). Esta bactéria tem a capacidade de inserir parte do plasmídio Ti no cromossomo das células das raízes de certas plantas e desta forma induzir a célula a se multiplicar, originando um tumor (daí o nome Ti). O número aumentado de células da planta produz as substâncias que a bactéria necessita. Pode se desenvolver plantas transgênicas ao infectar células vegetais com bactérias contendo um Ti modificado, em que se substitui os genes indutores de tumor por algum outro de interesse, como os genes que confiram resistência contra os herbicidas.

 

A microbiota ou microbioma humano: estima-se que vivam em nosso corpo um número de células bacterianas dez vezes maior que o número das nossas próprias células. Em grande parte, essas bactérias não nos causam enfermidades e em alguns casos, podem nos favorecer. Por exemplo, a presença delas dificulta o estabelecimento em nossos corpos de populações de micro-organismos patogênicos. De particular interesse recente são as bactérias residentes nos nossos intestinos, que podem produzir substâncias úteis, como as vitaminas K e várias vitaminas B, além de influenciarem na saúde geral. Convém notar que a composição dessa microbiota varia dependendo da dieta, sendo que dietas mais balanceadas, ricas em fibras, favorecem a prevalência de micro-organismos mais benéficos resultando em menos processos inflamatórios no intestino. Outros fatores que afetam o microbioma são o estresse/ansiedade, se o indivíduo teve o primeiro contato com esses micro-organismos no canal vaginal da mãe durante o parto normal e se passou por um período adequado de amamentação. Além das bactérias há também outros tipos de organismos, como os fungos.

 

Alguns efeitos que o microbioma intestinal pode ter em nossos organismos. Imagem: https://drjockers.com/10-ways-improve-gut-microbiome/. Tem muitas informações boas nesse link.

 

Sobre as doenças causadas pelas bactérias: em geral, as bactérias parasitas instalam-se em meio às células dos tecidos, onde podem causar dano ao destruir as células diretamente ou produzirem substâncias tóxicas que terminam por causar danos a elas.

 

A prevenção e o tratamento geralmente se dão com o uso de vacinas e antibióticos. Os antibióticos são substâncias produzidas por micro-organismos, capazes de matar ou inibir a proliferação de outros micro-organismos. Por exemplo, a penicilina é um antibiótico produzido pelos fungos do gênero Penicillium, e esta substância é capaz de impedir que a bactéria sintetize sua parede celular, então a bactéria lisa e morre.

 

A tabela a seguir resume algumas doenças causadas por bactérias:

 

DOENÇA	AGENTE ETIOLÓGICO	TRANSMISSÃO	PREVENÇÃO	SINTOMAS
Pneumonias bacterianas	Pneumococos, hemófilos, etc.	Gotículas em suspensão no ar.	Evitar o contato com os doentes; vacinação.	Tosse, febre, dor torácica.
Tuberculose	Bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis)	Gotículas em suspensão no ar.	Evitar o contato com os doentes; Condições salutares de moradia e alimentação; vacinação.	Febre, sudorese noturna,   tosse, emagrecimento, hemoptise (expectoração com sangue).
Hanseníase	Mycobacterium leprae	Contato com a pele dos doentes ou secreções nasais.	Evitar o contato com os doentes. A vacina contra a tuberculose também oferece proteção contra a lepra.	Lesões claras ou avermelhadas na pele; áreas com perda de sensibilidade tátil; nódulos; regiões de pele seca.
Tétano	Clostridium tetani	Contaminação de ferimentos.	Cuidado com os ferimentos; Vacinação.	Espasmos musculares; distúrbios respiratórios.
Cólera	Vibrio cholerae	Água e alimentos contaminados por fezes de doentes.	Isolamento dos doentes; Saneamento básico; Vacinação.	Diarreia intensa, vômitos, febre e dor abdominal.
Sífilis (veja mais sobre a sífilis na postagem sobre as ISTs).	Treponema pallidum	Contato sexual; Transmissão materno-fetal.	Abstinência; uso de preservativos.	Feridas   nos órgãos genitais (cancros duros); manchas na pele; lesões neurológicas.
Gonorreia	Neisseria gonorhoeae	Contato sexual; Transmissão no parto.	Abstinência; uso de preservativos.	Dor ao urinar; Corrimento vaginal ou uretral; dor durante as relações sexuais.
Antraz	Bacillus anthracis	Inalação ou ingestão de esporos.	Evitar locais onde animais contaminados morreram.	Infecção generalizada, pneumonia, febre e dificuldade para respirar.
Acne	Propionibacterium acnes	Proliferação excessiva da bactéria, nos folículos pilosos, graças ao aumento da secreção sebácea durante a adolescência.	Cuidar da higiene da pele. Existem antibióticos específicos para se tratar.	Inflamação dos folículos pilosos e formação de cravos e pústulas na pele.

Referências:

Livros de biologia do ensino médio da Sônia Lopes e Amabis, várias entradas sobre o assunto na Wikipedia e Britannica e nos links das imagens.

BIOTECNOLOGIA

BIOTECNOLOGIA 

Maximiliano Mendes

A biotecnologia é um campo de estudos multidisciplinar que combina os conhecimentos obtidos a partir da pesquisa empírica com os agentes biológicos, como os organismos, células, organelas e moléculas, a fim de produzir bens e serviços. Por exemplo:

• Obtenção de produtos que promovam a saúde humana ou animal. Ex: produção de insulina e hormônio de crescimento humanos em bactérias geneticamente modificadas.
• Modificar organismos (micro-organismos, plantas ou animais) para que sejam utilizados com fins específicos. Ex: desenvolvimento de micro-organismos capazes de atuar na recuperação de ambientes.
• Desenvolver novos processos industriais. Ex: pesquisas com o intuito de se obter glicose para a fermentação a partir da celulose das células da cana de açúcar, mas em nível industrial, o que pode aumentar a produção de álcool combustível.

Nesse resumo veremos algumas das técnicas e aplicações utilizadas na biotecnologia contemporânea, porém, é bom destacar que a biotecnologia nasceu talvez há 8.000 anos, quando o homem aprendeu a produzir vinhos e pães, mesmo sem ter qualquer noção de microbiologia, biologia molecular e metabolismo energético. Os procedimentos de biotecnologia vêm então sendo utilizados pela humanidade desde então, na produção de bens, seleção de rebanhos e etc. Abaixo se pode ver uma linha do tempo mostrando algumas descobertas de importância para a biotecnologia.

Na tabela abaixo estão destacados alguns processos biotecnológicos ou descobertas de interesse para a biotecnologia e quando foram descobertos. Modificada de Bruno et al. 2014.

Data	Processo / Descoberta
6000 a.C. – 2000 a.C.	Fermentação de grãos e cereais.
1675	Anton Van Leeuwenhoek observa micro-organismos com um microscópio simples.
1876	Louis Pasteur descobre que as leveduras são os micro-organismos responsáveis pela fermentação.
1928	Alexander Fleming descobre a penicilina.
1940	Fermentação industrial.
1953	Descobre-se a estrutura das moléculas de DNA.
1973	Início da engenharia genética.
1981	Primeira planta transgênica.
1996	Clonagem da ovelha Dolly.
2003	Projeto genoma humano completo.

Atualmente se executam nos laboratórios uma miríade de procedimentos que podemos considerar como dentro do âmbito da biotecnologia: desde preparar uma lâmina para observar algum material no microscópio até centrifugar uma amostra biológica com vistas a purificar algum componente. Porém, nosso interesse e foco aqui, serão as tecnologias de manipulação do DNA, como a tecnologia do DNA recombinante, que objetiva mesclar fragmentos de moléculas de DNA distintas, podendo ser, inclusive, de diferentes organismos, gerando DNAs recombinantes. Vejamos a seguir, algumas técnicas, ferramentas e procedimentos de destaque:

Enzimas de restrição

Uma das ferramentas mais utilizadas para se gerar moléculas de DNAs recombinantes são as chamadas enzimas de restrição (ou endonucleases de restrição), enzimas proteicas encontradas em bactérias e arqueas, descobertas no final dos anos 1960 e cuja função básica é restringir as infecções virais: essas enzimas são capazes de quebrar moléculas de DNA em sequências palindrômicas específicas (ver figura adiante). As bactérias e arqueas conseguem proteger suas moléculas de DNA da ação dessas enzimas ao adicionarem radicais metila, -CH₃ em citosinas e adeninas na sequência palindrômica alvo da enzima. A figura a seguir mostra como uma dessas enzimas, a Eco RI, de Escherichia coli pode atuar.

Nos pontos de corte das moléculas de DNA, podem ser inserido outros fragmentos, contendo genes de interesse, como veremos posteriormente aqui.

Eletroforese

A eletroforese é uma técnica que permite separar fragmentos de DNA, como os gerados pelas enzimas de restrição (também é possível separar proteínas com essa técnica). A ideia básica é a seguinte: fazer os diversos fragmentos migrarem ao longo de um gel imerso em uma solução, após posicionar esses fragmentos em uma das extremidades do gel. Esse gel possui poros, como se fosse uma esponja, por isso permite a migração de moléculas ao longo dele. Para fazer com que os fragmentos de DNA migrem, basta submeter esse conjunto a um campo elétrico, de forma que o polo negativo corresponda à extremidade onde se colocam os fragmentos de DNA, que são naturalmente negativamente carregados, para que eles migrem em direção a extremidade oposta, o polo positivo.

Os fragmentos podem ser separados, pois, dependendo do tamanho, migrarão em velocidades distintas ao longo do gel: os menores migram mais rapidamente e ao término do procedimento estão mais próximos do polo positivo, os maiores migram mais lentamente e terminam mais distantes do polo positivo. A figura a seguir resume o procedimento.

OBS: nessa imagem os retângulos vermelhos, chamados bandas, não representam uma molécula ou fragmento de DNA, mas sim, um conjunto de fragmentos ou moléculas. As amostras contêm fragmentos de tamanhos diversos, já as bandas separadas contêm vários fragmentos do mesmo tamanho.

Os retângulos contendo fragmentos de DNA de mesmo tamanho são chamados bandas. Para observar as bandas é necessário aplicar às amostras uma substância chamada brometo de etídio (carcinogênica!), que se liga ao DNA e emite luz se for irradiado com raios UV (também carcinogênicos!).

Essa técnica é usada em diversos procedimentos em biotecnologia e biologia molecular. Por exemplo, ela permite identificar pessoas, seja para investigações criminais ou para processos judiciais como os de confirmação de paternidade. Como? O DNA humano apresenta sequências curtas, de 9 a 80 pares de bases, chamadas VNTR – Número variável de repetições em sequência (Variable Number of Tandem Repeats). Essas sequências variam em número de repetições de pessoa para pessoa e também podem variar entre dois cromossomos homólogos de uma mesma pessoa. Por exemplo, um indivíduo pode ter em um de seus cromossomos uma VNTR com quatro repetições e no homólogo, na posição equivalente, a VNTR pode ter seis. Ou então, outro indivíduo pode ter duas VNTR na mesma posição nos dois homólogos e ainda, um terceiro ter três VNTR na mesma posição nos dois homólogos. Com essas diferenças em mente, ao se digerir o DNA de uma amostra qualquer com uma enzima de restrição que atue delimitando as VNTRs, obtêm-se fragmentos de tamanhos diversos, que podem ser comparados ao se analisar o padrão de bandas dessas amostras após utilizar o processo de eletroforese para separar os fragmentos. Como o nome indica, essas sequências são muito variáveis e, por conta disso, dificilmente dois indivíduos não aparentados apresentarão as mesmas, então, normalmente o grau de confiabilidade desses testes é muito alto, com uma precisão acima de 99 %. Veja a figura abaixo.

Clonagem molecular

A clonagem de sequências de DNA consiste em gerar várias cópias de uma mesma sequência ou fragmento de molécula de DNA, que inclusive pode conter um gene. Uma forma de se fazer isso é gerar uma molécula de DNA recombinante e inseri-la em uma bactéria para que seja multiplicada (clonada) ou algum produto gênico seja produzido.

A técnica básica consiste em utilizar uma enzima de restrição para cortar um plasmídeo bacteriano e a molécula de DNA que contém o gene que se quer clonar. Esses plasmídeos são chamados de vetores de clonagem. Os genes de interesse podem então ser ligados aos plasmídeos vetores e, uma vez inseridos nas bactérias, esses plasmídeos serão multiplicados (inclusive na medida em que as bactérias se multiplicam), gerando vários clones com os genes de interesse. Veja as imagens abaixo:

Esse é o plasmídeo vetor:

O plasmídeo vetor sofre a ação da enzima de restrição:

A molécula de DNA onde está o fragmento de interesse também deve sofrer a ação do mesmo tipo de enzima de restrição, de forma que o corte se dê na mesma sequência alvo e gere extremidades coesivas.

Enfim, o fragmento de DNA de interesse é inserido no plasmídeo vetor.

Os plasmídeos recombinantes podem ser inseridos nas bactérias graças ao processo de transformação (lembre-se de que as bactérias podem receber moléculas de DNA exógenas por transformação, conjugação ou transdução). O método empregado para se fazer isso é a eletroporação, que consiste em aplicar um pulso elétrico na solução, criando poros nas células por onde os plasmídeos podem entrar.

Observando de novo a figura do plasmídeo onde o gene de interesse será incluído, note que é muito útil, em se tratando do processo de clonagem com o uso de Escherichia coli, que os plasmídeos vetores tenham um gene que confira resistência contra algum antibiótico, como o gene amp^R, que confere resistência contra o antibiótico ampicilina e, assim, permite que apenas as bactérias que adquiriram o plasmídeo vetor recombinante possam crescer em um meio de cultura contendo esse antibiótico. A ideia é eliminar as bactérias que não captaram o plasmídeo vetor, pois elas não geram o produto de interesse e consomem os recursos do meio de cultura.

Outro gene de interesse, que convém estar presente em um plasmídeo vetor é o LacZ, que codifica  a enzima beta-galactosidase. Essa enzima permite às bactérias hidrolisarem o dissacarídeo lactose, ou uma substância sintética chamada X-gal. Nesse segundo caso, a hidrólise gera um produto azul de fácil detecção. Novamente, o objetivo é selecionar apenas as bactérias de interesse, pois a ideia é que o sítio da enzima de restrição esteja localizado no meio do gene LacZ, de forma que  quando o gene de interesse é inserido nesse local, o gene da LacZ é interrompido e deixa de ser funcional. Além disso, as E. coli utilizadas nesse tipo de procedimento têm o gene LacZ defeituoso. Assim, as colônias de bactérias que receberam o plasmídeo vetor recombinante contendo o gene de interesse são as que não apresentarem cor azul.

Ainda, é desejável que antes do sítio da enzima de restrição, onde o gene será inserido, o plasmídeo vetor tenha um promotor muito ativo, de forma a promover a expressão do gene e a obtenção de seu produto (lembre-se de que o promotor é a sequência onde o complexo enzimático RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição gênica). Também, é preferível, no caso da clonagem em bactérias, que o gene clonado tenha sido obtido de um cDNA (veremos mais sobre eles adiante), pois caso o gene contenha íntrons, não serão processados adequadamente pelas células bacterianas, visto que elas não possuem a maquinaria necessária para retirá-los.

Tendo em vista essas limitações, em biotecnologia, além das bactérias, também se podem utilizar leveduras, que apresentam algumas vantagens: também podem ser cultivadas com facilidade, possuem plasmídeos, são capazes de processar pré mRNAs contendo íntrons e efetuar processamento pós traducional. Para a clonagem em leveduras podem se utilizar plasmídeos ou cromossomos artificiais de leveduras (chamados YACs – Yeast Artificial Chromosomes). Os DNAs recombinantes também podem ser inseridos nas leveduras por eletroporação.

Bibliotecas de DNA e hibridização de ácidos nucleicos

Com o plasmídeo vetor inserido em bactérias, como fazer para selecionar os clones que contêm o gene de interesse em meio a tantos outros? O primeiro passo é construir uma biblioteca de DNA, que contém diversos plasmídeos recombinantes distintos com diversos fragmentos de restrição. Veja a sequência de imagens a seguir:

Primeiro são gerados os fragmentos de restrição:

Os fragmentos são inseridos em plasmídeos vetores:

Por fim, esses plasmídeos são inseridos em bactérias, que multiplicam a si e aos plasmídeos: é a biblioteca.

Outro tipo de biblioteca é a de DNA complementar (cDNA). Nesse caso, extrai-se mRNA das células e com o uso de transcriptases reversas se obtêm cDNAs. Note que esse tipo de biblioteca representa apenas parte do genoma, pois não contém os íntrons. Esses cDNAs devem ser modificados com a adição de sequências contendo sítios de restrição em ambas as extremidades, de modo que possam então ser inseridos em vetores diversos, como os plasmídeos que estamos exemplificando. Porém, existem outros tipos de vetores, como o DNA dos vírus bacteriófagos e os cromossomos bacterianos artificiais (que são plasmídeos enormes). A figura abaixo resume o procedimento, compare os comprimentos dos cDNAs (sem íntrons) com os dos genes originais:

Enfim, para detectar o gene de interesse no DNA de um clone bacteriano é possível usar a técnica de Southern Blot. O procedimento básico consiste em separar fragmentos de restrição por eletroforese e detectar aqueles de interesse ao permitir que sequências de DNA cadeia simples chamadas sondas, cuja sequência de bases é complementar ao nosso gene de interesse venham a se ligar a eles por conta da complementariedade das bases nitrogenadas. Os passos do procedimento básico são os seguintes:

1. Obtêm-se fragmentos de restrição a partir das moléculas de DNA que se quer investigar (descobrir onde está o gene de interesse).
2. Separam-se os fragmentos de restrição de diferentes tamanhos por eletroforese em gel.
3. As cadeias de DNA são separadas/desnaturadas ao se submeter o gel à uma solução alcalina de NaOH.
4. Comprime-se uma folha de nitrocelulose (negativamente carregada) no gel de forma que alguns fragmentos de restrição desnaturados irão se ligar nessa folha. Outros tratamentos, como o aquecimento, são necessários para que o DNA se fixe adequadamente.
5. Incuba-se a membrana de nitrocelulose com os fragmentos de restrição de cadeia simples, aderidos, em uma solução contendo as sondas de cadeia simples para que elas possam se hibridizar, ou seja, ligarem-se de acordo com a complementariedade das bases nitrogenadas. Note que é necessário que saibamos pelo menos parte da sequência de DNA do gene ou do seu mRNA, para que possa haver essa ligação. As sondas podem ser marcadas com isótopos radioativos, substâncias fluorescentes, ou enzimas capazes de gerar produtos fluorescentes para que se possam detectar os clones com maior facilidade.
6. Por fim, para saber quais são os fragmentos de restrição contendo o gene procurado (e assim, quais bactérias possuem os clones de interesse) observa-se em quais bandas de fragmentos de restrição separados houve a ligação das sondas marcadas. Isso pode ser feito, por exemplo, caso se tenha usado sondas marcadas com materiais fluorescentes ou radioativos, expondo-se a membrana de nitrocelulose aos raios-X.

A figura abaixo resume o processo.

Organismos transgênicos

Um organismo que tem algum gene ou fragmento de DNA de outro organismo distinto, inserido em seu genoma é chamado transgênico. Se é possível inserir um gene de um organismo distinto, como um humano, em uma bactéria, por que não ir adiante e tentar inserir genes nos genomas de outros tipos de organismos, mais complexos, como plantas e animais?

É possível obter mamíferos transgênicos ao se inserir o fragmento de DNA de interesse no núcleo de uma célula ovo que esteja sendo fertilizada in vitro. A primeira etapa desse método é iniciar a fertilização in vitro de uma célula ovo e, durante o processo, inserir os fragmentos de DNA de interesse no pronúcleo masculino. Alguns dos fragmentos de DNA de interesse serão inseridos no DNA cromossomal desse pronúcleo, gerando moléculas de DNA recombinante. Posteriormente, implantam-se os embriões no útero de uma fêmea e, assim, obtêm-se os animais transgênicos, capazes de produzir algum produto gênico de interesse.

Para se originar uma planta transgênica, uma possibilidade é inserir os fragmentos de DNA de interesse em um plasmídeo chamado Ti (indutor de tumor) da bactéria Agrobacterium tumefaciens. Essas bactérias são capazes de inserir o plasmídeo Ti no interior das células das plantas e ele possui uma região capaz de se inserir no DNA cromossomal, transformar a célula e gerar um tumor. Dessa forma são geradas várias células com o gene de interesse que podem ser isoladas e cultivadas em cultura, desenvolvendo-se em plantas transgênicas.

Outra forma é a chamada biobalística, na qual se aderem os fragmentos de DNA de interesse em microesferas de ouro. Essas esferas são disparadas, literalmente, no interior da célula e assim, os fragmentos de DNA podem se inserir no genoma da célula vegetal.

Uma grande facilidade em se trabalhar com os vegetais, nesse âmbito, é que é possível gerar uma planta completa a partir de uma ou poucas células vegetais transgênicas. Já com as células animais, esse procedimento não é possível.

Os procedimentos de geração de organismos transgênicos geram diversas discussões controversas, pois, se por um lado um OGM pode gerar mais de um produto de interesse comercial e até, em tese, diminuir os custos, mas por outro, como estimar quais são os possíveis impactos ambientais que os OGM podem ter? Acredita-se que em alguns casos, os OGM possam ter o metabolismo alterado no sentido de produzir mais de alguma substância tóxica ou que nos cause alergias. Quais populações terão acesso aos produtos? A técnica vai promover o bem estar geral ou acentuar as desigualdades socioeconômicas? São questões ainda não resolvidas.

A reação em cadeia da polimerase - PCR

A PCR é uma técnica criada em 1985, que permite multiplicar fragmentos de DNA rapidamente. Tanto a PCR quanto a clonagem permitem multiplicar fragmentos de DNA, porém, a PCR é mais rápida que a clonagem e mais adequada para as situações nas quais uma amostra é impura ou contém poucas quantidades do DNA de interesse a ser amplificado, como por exemplo, DNA retirado de cenas de crime ou DNA de organismos mortos há muito tempo. Com o uso da PCR se pode então identificar amostras de DNA de suspeitos de crimes, confirmar se alguém está infectado por algum vírus, identificar se determinada amostra de DNA pertence a uma determinada espécie de organismo, amplificar um gene de interesse e etc.

De maneira resumida, a técnica consiste na repetição das seguintes etapas:

1. A mistura contendo os fragmentos de DNA que se deseja amplificar deve ser aquecida até 94° - 96° C, para desnaturar as cadeias de DNA. Nesse caso, a desnaturação consiste na quebra das ligações de hidrogênio que unem as duas cadeias, separando-as. Essa mistura contém também alguns fragmentos curtos de DNA de cadeia simples chamados de iniciadores (ou primers). Os iniciadores possuem uma sequência de nucleotídeos complementar às extremidades do DNA que se quer amplificar (que deve ser conhecido, pelo menos em parte).
2. Em seguida a mistura é resfriada até uma temperatura que permita haver a ligação ou anelamento dos iniciadores de cadeia simples, graças à complementariedade de bases, nas extremidades do DNA que se quer amplificar. Essa temperatura pode ser de aproximadamente 50° - 60° C.
3. Por fim, a temperatura é novamente elevada e uma DNA polimerase extraída da bactéria Thermus aquaticus cuja temperatura ótima de atividade é por volta de 70° C utiliza as extremidades 3’-OH providas pelos iniciadores ligados para sintetizar novas cadeias de DNA. Ao término, cada molécula de DNA foi duplicada.

Dessa forma, cada ciclo tem o potencial de dobrar a quantidade de DNA de interesse presente em uma amostra, podendo se obter milhões de fragmentos em poucas horas.

O sequenciamento de genomas

O sequenciamento consiste em decifrar a sequencia completa de todos os pares de bases (pb) de um determinado genoma. O primeiro genoma completamente sequenciado foi o da bactéria Haemophilus influenzae em 1995 e hoje em dia há vários outros genomas sequenciados, inclusive os três bilhões de pb do nosso genoma graças ao projeto genoma humano, completo em 2003. A técnica de sequenciamento básica existe desde 1980 e é chamada de método de terminação da cadeia com didesorribonucleotídeos (ou método de Sanger). Esse método consiste em se gerar fragmentos de restrição e elucidar a sequência de nucleotídeos deles de acordo com os seguintes passos:

1. Desnatura-se o fragmento em cadeias simples e eles são adicionados em uma solução contendo oligonucleotídeos iniciadores, DNAs polimerases, os desoxirribonucleotídeos componentes das cadeias de DNA (dATP, dCTP, dTTP e dGTP) e nucleotídeos sintéticos chamados didesoxirribonucleotídeos marcados com substâncias fluorescentes para que sejam detectados facilmente. As DNAs polimerases na solução iniciam a síntese de cadeias de DNA com os monômeros disponíveis.
• A ideia é que cada base nitrogenada presente em um didesoxirribonucleotídeo emita fluorescência de cor diferente. Esses didesoxirribonucleotídeos não possuem nenhum grupo hidroxila (-OH) na pentose, de forma que, sem uma hidroxila, a DNA polimerase não pode continuar a síntese da cadeia de nucleotídeos. Assim, os didesoxirribonucleotídeos terminam a cadeia e geram fragmentos de tamanhos diversos, que emitem luz fluorescente.
2. Separam-se os fragmentos utilizando o processo de eletroforese, mas em gel de poliacrilamida (ao invés da agarose, comumente usada para o DNA), pois esse gel forma poros menores e permite separar fragmentos menores e com maior precisão.
3. A sequência do fragmento de DNA é decifrada ao se observar a sequencia dos pedaços formados de baixo para cima, ou em outras palavras, os fragmentos menores passam primeiro e os maiores por último. Cada fragmento detectado emite luz fluorescente de uma cor diferente, correspondente à sua base nitrogenada.

Clonagem de animais

Talvez a técnica mais conhecida para se gerar clones de animais adultos, como foi o caso da ovelha Dolly em 1997, é o transplante nuclear. Nesse caso, inicialmente obtêm-se uma célula adulta do indivíduo que se quer clonar e um ovócito de outra ovelha.  Em seguida, retira-se o núcleo do ovócito e se aplicam pulsos elétricos para fundir as duas células. Dessa forma, obtém-se um ovócito contendo o núcleo (e outros componentes celulares) da célula adulta originária do indivíduo que se quer clonar. Depois, aplicam-se mais pulsos elétricos para promover as divisões desse ovócito. Caso gere um embrião, ele será implantado no útero de uma terceira ovelha (“mãe de aluguel”), podendo continuar o seu desenvolvimento e chegar à idade adulta.

É interessante notar que os animais clonados a partir do uso desse método podem vir a apresentar diversos problemas de saúde, pois além da célula ovo receber componentes citoplasmáticos de uma célula adulta, já diferenciada, também recebe material genético que já sofreu mudanças epigenéticas e tem genes inativados.

Assim como nos casos dos organismos geneticamente modificados, a clonagem também gera discussões, pois, se por um lado os clones de algum animal poderiam ter grandes vantagens e se multiplicarem, produzindo mais, por outro, a população de clones perde em variabilidade genética e se torna mais suscetível às adversidades ambientais. Ainda há a discussão sobre a clonagem de humanos, para quê e para quem? De novo, são questões não resolvidas. 

Adendos:

A edição gênica com CRISPR-Cas9

Uma técnica recente que tem sido amplamente utilizada na expressão de genes heterólogos em diversos tipos de organismos, inclusive animais, e tem facilitado muito esse tipo de trabalho é a que utiliza o sistema bacteriano chamado CRISPR-Cas9 (de repetições palindrômicas curtas, agrupadas e interespaçadas regularmente, em associação com a endonuclease 9).

O termo CRISPR se refere a uma região no DNA cromossomal dos procariontes onde se localizam sequências de DNA de procedência viral (as sequências espaçadas regularmente). É um registro dos vírus que já infectaram as linhagens dessas células, mas cujas moléculas de DNA foram cortadas e alguns fragmentos foram inseridos nessa região. Essas informações são usadas em uma espécie de sistema de defesa imunitária das bactérias que emprega endonucleases de restrição, enzimas capazes de cortar moléculas de DNA em sequências palindrômicas específicas.

As Cas (CRISPR Associated) são endonucleases de restrição cujos genes se localizam em um operon nas proximidades de CRISPR. As Cas9, por exemplo, formam um complexo com uma molécula de RNA guia ou rastreadora, sendo que essa molécula de RNA provém de alguma sequência CRISPR e é usada no reconhecimento e corte de moléculas de DNA virais. Ao ser infectada por um vírus, a célula procarionte produz os complexos CRISPR/Cas9 com o RNA guia de sequência complementar a uma região do material genético viral. Após o reconhecimento e interação entre as cadeias de RNA associada a Cas9 e o material genético viral, Cas9 corta o ácido nucleico viral, impedindo a infecção.

No âmbito da biotecnologia, a ideia é usar uma molécula de RNA guia (sintetizada artificialmente) imitando os transcritos CRISPR e que, associada à endonuclease Cas9, pode se ligar na molécula de DNA alvo no ponto específico que se quer cortar. A partir do corte, pode se inserir novas sequências de DNA na molécula alvo, como um gene, ou então os mecanismos de reparo das células podem inserir ou deletar (retirar) sequências de nucleotídeos de forma a inativar um gene. Já foram efetuadas até modificações em embriões humanos com o uso dessa técnica.

A endonuclease Cas 9 (azul claro) com um RNA guia, que pode ser procedente das sequências CRISPR ou então, manipulado, de maneira a reconhecer, por conta da complementariedade de bases, uma sequência em uma molécula de DNA alvo. Uma vez havendo o reconhecimento, a molécula alvo é cortada e no ponto de corte podem ser inseridos genes de interesse. Imagem: http://cen.acs.org/articles/92/i39/Patent-Picks-CRISPRCas9-Gene-Editing.html

Referências

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Bruno, NA. et al. Biotecnologia I: Princípios e Métodos. Artmed. 2014.

Campbell, Reece et al. Biologia. 8ª ed. Artmed. 2010.

http://biotechlearn.org.nz/focus_stories/transgenic_cows/making_a_transgenic_animal

https://www.labmate-online.com/news/news-and-views/5/breaking-news/the-pros-and-cons-of-genetically-modified-organisms-gmos/31400

http://www.genetica.esalq.usp.br/pub/seminar/BMLima-200901-Resumo.pdfhttp://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

http://en.wikipedia.org/wiki/Recombinant_DNA

http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme

https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_profiling

http://www.nature.com/scitable/definition/polymerase-chain-reaction-pcr-110

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http://en.wikipedia.org/wiki/Whole_genome_sequencing

http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/paternitytesting.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/Southernblot.html

http://croptechnology.unl.edu/animation/GeneGun.swf

http://www.scq.ubc.ca/plant-breeding-versus-plant-genetics/

http://learn.genetics.utah.edu/content/cloning/clonezone/

http://revistapesquisa.fapesp.br/2016/02/19/uma-ferramenta-para-editar-o-dna/

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology